Cáncer: terapias y tratamientos

Una visión diferente sobre el cáncer

Unidade de Imunologia Molecular

Posted by licinia en octubre 14, 2006

Descrição / Objectivos

A imunidade contra agentes infecciosos é garantida por “glóbulos brancos” de vários tipos. Particularmente importantes são os linfócitos T, que montam respostas celulares contra células o, activação e regulação dos linfócitos T. Visamos a identificação de moléculas relevantes para esses processos, e a sua integração em mecanismos celulares responsáveis pelas acções linfocitárias. Os conhecimentos obtidos através desta investigação fundamental poderão ser aplicados ao design de novas terapias nas áreas do cancro e de patologias que envolvem desregulação do sistema linfocitário, como doenças inflamatórias e autoimunes.

Coordenador

Bruno Silva-Santos, PhD – Professor Auxiliar, FML CV

EQUIPA DE INVETIGAÇÂO

Daniel Correira Biólogo Estagiário

Francisco D’Orey Estudante de Maestrado

ÁREA DE INVESTIGAÇÃO

A nossa prioridade actual é o estudo do desenvolvimento e da função de linfócitos T do subtipo gd, isto é, caracterizados pela expressão de um receptor específico para antigénios (TCRgd). Apesar destas células estarem claramente implicadas nos contextos da inflamação e do cancro, os seus mecanismos moleculares e celulares permanecem um mistério, e esperamos por isso fazer contribuições importantes nestas áreas.

PROJECTOS DE INVESTIGAÇÃO
1. Desenvolvimento de linfócitos TOs linfócitos T são gerados num órgão especializado, o timo. Este recebe células precursoras da medula óssea e promove processos de diferenciação que levam à aquisição de receptores específicos para antigénios (TCR, T cell receptor). Assim se geram várias linhagens de linfócitos T, incluindo os supra-citados gd. De entre as células que expressam um outro subtipo de receptor – TCRab -, existe uma linhagem com alta capacidade regulatória, isto é, capaz de controlar a actividade de outros linfócitos T. Estas células designam-se de reguladoras e são caracterizadas pela expressão dos marcadores CD4 e CD25. Vários estudos demonstraram que esta linhagem de linfócitos T é crucial para a protecção relativa a doenças inflamatórias e autoimunes.
Nós estamos interessados nos sinais que determinam a geração de células T gd, por um lado, e T-reguladoras (“T-reg”), por outro. Investigamos o envolvimento de receptores de antigénio, receptores de citocinas (moléculas que fazem comunicação entre células), factores de sobrevivência e factores de transcrição. Visamos expandir o nosso trabalho anterior que conduziu à proposta de um novo modelo para o desenvolvimento de células T gd (in Science 2005, vol. 307, pág. 925-928; ver Figura 1). Estes conhecimentos permitir-nos-ão compreender melhor o funcionamento da diferenciação tímica, vital para a imunidade a infecções, por um lado, e para o controlo da autoimunidade, por outro.

Figura 1 – Modelo de diferenciação tímica (in D. Pennington & B. Silva-Santos, Curr. Opin. Immunol. 2005, vol. 17, pág. 108-115). Progenitores oriundos da medula óssea (LSK) entram o timo como células CD4- CD8- (“duplamente negativas”, DN), que seguem um processo de maturação através de 4 estadios (DN1-4) prévios à expressão do receptor específico de células T (TCR). Dois tipos de TCR podem ser usados: TCRgd ou TCRab. Este último surge num estadio designado de “duplamente positivo” (DP), dada a co-expressão das proteínas de superfície CD4 e CD8. Estes DP são progenitores dos timócitos maduros SP4 (CD4+ CD8-) e SP8 (CD4- CD8+), os quais deixam o timo para exercer as suas funções linfocitárias na periferia. Nós descrevemos pela primeira vez (in B. Silva-Santos et al., Science 2005, vol. 307, pág. 925-928) como as células DP também têm uma outra função, a de condicionar a diferenciação (e a função) dos timócitos gd através da citocina linfotoxina (setas verdes).

O fenótipo de modelos animais geneticamente deficientes em linfócitos T gd sugere claramente a existência de sub-populações de células com capacidade regulatória dentro desta linhagem. Assim, ratinhos desprovidos de linfócitos T gd têm uma incidência muito elevada (relativa a animais-controlo) de respostas inflamatórias, particularmente na pele, no intestino e no cérebro. E o impacto patológico em modelos animais de algumas doenças autoimunes, como lúpus e esclerose múltipla, é também exagerado na ausência destas células.
Porém, as sub-populações regulatórias de linfócitos T gd ainda não foram caracterizadas, desconhecendo-se a sua identidade dentro duma linhagem claramente muito heterogénea. Para abordar este problema, nós purificamos células T gd extraídas de diversos tecidos, usando múltiplos marcadores de superfície, e testamos a sua actividade T-supressora, isto é, a capacidade de inibir a proliferação de outros linfócitos T (CD4+ CD25- ou CD8+), em ensaios in vitro (ver Figura 2a) e in vivo.
As populações isoladas são também analisadas relativamente a expressão de genes e proteínas importantes para a actividade reguladora descrita para as células CD4+ CD25+: por exemplo, CTLA-4, GITR e Foxp3 (ver Figura 2b).

Figura 2 – Dados de citometria de fluxo (FACS): a) Proliferação de células efectoras CD4+ CD25- após 4 dias em cultura, na ausência (painel de cima) ou na presença (painel de baixo) de células T-reguladoras CD4+ CD25+. As células efectoras foram marcadas com um composto fluorescente (CFSE), ao contrário das T-regs (que não aparecem no gráfico). Cada pico representa uma divisão celular, já que a intensidade de fluorescência (conteúdo de CFSE) é reduzida a metade de uma célula-mãe para cada uma das células-filhas. Repare-se como as T-regs inibem a proliferação das células efectoras (a percentagem indica células que não proliferaram). b) Expressão do factor de transcrição Foxp3 em linfócitos CD4+ do baço. Repare-se que a maioria das células que expressa esta proteína é também CD25+ (definindo a população T-reg CD4+ CD25+).

O papel específico de algumas moléculas supressoras na actividade das populações em estudo é analisado através do uso de anticorpos que bloqueiam a sua acção, ou recorrendo a ratinhos deficientes nas moléculas em causa.
Estamos também interessados em estender os resultados adquiridos em modelos animais a amostras humanas, obtidas do Hospital de Santa Maria.
3. Mecanismos moleculares de reconhecimento e activação de linfócitos T gd na sua acção anti-tumoralAlém do fenótipo inflamatório descrito em (2), os animais desprovidos de células T gd são particularmente susceptíveis ao desenvolvimento de tumores. Para mais, as células gd são muito eficazes na destruição (citólise) in vitro de células tumorais, nomeadamente humanas, de origem variada (linfomas, leucemias, carcinomas, etc.). Porém, os mecanismos moleculares responsáveis pela acção anti-tumoral dos linfócitos T gd permanecem desconhecidos: como é que estes linfócitos reconhecem as células tumorais como um alvo para o seu ataque citolítico, e como são activados para exercer essa função?
Para respondermos a estas questões, nós analisamos linhas celulares tumorais, de origem humana ou de ratinho, que têm a capacidade de activarem os linfócitos T gd, e comparamos o seu repertório de proteínas de membrana com o de células que não estimulam os mesmos linfócitos. Como complemento, usamos ferramentas bioinformáticas para identificar (através de uma série de critérios estruturais) potenciais candidatos no genoma humano e no genoma de ratinho.
As moléculas seleccionadas são estudadas ao nível da sua expressão (por real-time polymerase chain reaction) num largo painel de linhas celulares tumorais e amostras de tumores extraídos de pacientes ou de modelos animais.
Aspectos da biologia celular dos candidatos são considerados em experiências de imunofluorescência e bioquímica, que também visam a identificação de parceiros moleculares dos candidatos em estudo – nomeadamente, receptores nos linfócitos T gd que interagem com ligandos-candidatos expressos nas células tumorais.
Finalmente, usamos a metodologia de RNA-interferência para reduzir a expressão dos candidatos em linhas celulares tumorais e analisar o impacto desta manipulação na actividade citolítica dos linfócitos T gd. A acção linfocitária é testada quer in vitro (contra células de origem humana ou de ratinho), quer in vivo (em modelos animais de desenvolvimento de tumores).
 

COLABORAÇÕES


– Prof. Adrian Hayday, King’s College London, Londres, Reino Unido.
– Dr. Daniel Pennington, Queen Mary’s School of Medicine, Londres, Reino Unido.
– Dr. Michael Girardi, Yale University School of Medicine, Estados Unidos da América.
– Dra. Jocelyne Demengeot, Instituto Gulbenkian de Ciência, Oeiras, Portugal.
 

ACTIVIDADES PEDAGÓGICAS

Bruno Silva-Santos é professor da disciplina de Imunologia Básica dos cursos de Medicina, Microbiologia e Nutrição da Faculdade de Medicina de Lisboa.
 

PRÉMIOSBruno Silva-Santos foi nomeado “Investigador do Ano” do King’s College London em 2005.PUBLICAÇÕES SELECCIONADAS

B. Silva-Santos*, D. J. Pennington* and Adrian C. Hayday (2005), Immunol. Reviews, In press.

B. Silva-Santos*, D. J. Pennington* and Adrian C. Hayday (2005), Science 307, 925-8.

B. Silva-Santos*, D. J. Pennington* and Adrian Hayday (2005), Curr. Opin. Immunol. 17, 2: 108-115.

B. Silva-Santos*, D. J. Pennington*, J. Shires, E. Theodoridis, C. Pollit, E. L. Wise, R. Tigelaar, M. J. Owen and Adrian C. Hayday (2003), Nature Immunol. 4, 10: 991-9.

C. Trigueros, K. Hozumi, B. Silva-Santos, L. Bruno, A. C. Hayday, M. J. Owen, D. J. Pennington (2003), Eur. J. Immunol. 33, 1968-1977. “Transplantation Tolerance”. The Journal of Immunology, 165: 4783-6. (2000)

Contactos

Correio electrónico: bssantos@fm.ul.pt Extensão 47240
Fax: 217 985 142
Correio postal: Unidade de Imunologia Molecular
Instituto de Medicina Molecular
Faculdade de Medicina de Lisboa
Av. Prof. Egas Moniz
1649-028 Lisboa

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